曲晓刚研究员，最新Nature Catalysis！

成果简介

生物正交化学（Bioorthogonal chemistry）原位生成治疗剂为疾病治疗提供了新的途径，但是走向实际应用，必须考虑两个关键问题：一是防止原位合成药物分子的代谢失活；二是提高生物正交催化剂的生物相容性和肿瘤细胞选择性。

基于此，中国科学院长春应用化学研究所曲晓刚研究员（通讯作者）等人报道了一个基于生物相容性氢键有机骨架（HOF）的双前药活化平台（Apt@E-F@PHOF-1），实现肿瘤微环境响应双前药生物正交激活策略，并选择抗癌药物5-氟尿嘧啶（5FU）和二氢嘧啶脱氢酶（DPD）抑制剂5-乙炔基尿嘧啶（5EU）作为模型双药物。

在该策略中，作者首先设计了一种由Fe(III)中四(4-羧基苯基)卟啉氯（FeTCPP）组成的生物相容性铁卟啉生物正交预催化剂（即PHOF-1）。

然后，将5FU前药（pro-5FU）和5EU前药（pro-5EU）原位封装到PHOF-1中，最后在PHOF-1表面修饰AS1411适体以靶向攻击癌细胞的核素。PHOF-1既是生物正交预催化剂，也是抗癌前药pro-5FU和pro-5EU的载体。

该生物正交体系具有以下优点：（1）双药同时激活可以增加5FU的生物利用度，维持5FU的长期高浓度，从而有效化疗，因为5EU通过抑制DPD酶有效阻止5FU失活；（2）适体靶向和GSH触发的衰老是确保肿瘤选择性前药精确激活和避免过早释放和清除的双重保障；（3）HOF-基设计使该生物正交平台具有良好的生物相容性。它是HOF基生物正交前药激活的首个例子，提出了一种有前途的方法来增强肿瘤抑制和减少治疗副作用。

图1. HOF-基生物正交前药激活用于化疗

研究背景

生物正交化学在生物学和生物医学领域具有独特的应用潜力，通过生物正交反应激活前药是降低药物毒性和减轻药物不良反应的一种很有前景的方法。

尽管在这一领域取得了一些成就，但在实际应用中必须考虑两个关键问题：（1）如何防止药物失活，这是导致临床疗效不理想的关键因素；（2）如何提高生物正交催化剂的生物相容性和肿瘤细胞选择性。大多数生物正交催化剂在未经改性的情况下，通常表现出较差的生物相容性和选择性，从而限制了它们在生物医学和生物医学上的应用。

最近报道了一种新的生物正交预催化剂铁卟啉，它可以在谷胱甘肽（GSH）等巯基存在下催化叠氮化物还原为氨基。鉴于肿瘤细胞中GSH浓度高于正常细胞，铁卟啉基生物正交催化剂可通过GSH触发的生物正交反应来保证肿瘤的选择性。

然而，铁卟啉受其生物相容性的限制。氢键有机骨架（HOF）是一种新型的多孔晶体固体，具有生物相容性好、合成简单、毒性低等优点，已成功应用于蛋白质或细胞的包封、药物传递、生物传感、抗生素和疾病治疗等领域。

图文导读

合成与表征

作者选择了FeTCPP作为构建单元，在室温条件下，在乙醇-H₂O水溶液中合成卟啉HOF（PHOF-1），并制备了纳米级的PHOF-1。

具体而言，两个FeTCPP分子通过桥接O原子连接形成结构单元μ-O-[FeTCPP]₂，它们面对面交错形成轮式结构。每个结构单元被另外6个结构单元包围，每个结构单元平均产生4个氢键。H∙∙∙O氢键体系（H∙∙∙O）有两种类型的氢键，分别为1.7 Å和1.8 Å，O – H∙∙∙O的角度分别为161.4°和155.7°。在结构单元μ-O-[FeTCPP]₂中，Fe-Fe距离为3.5 Å，Fe-O距离为1.761 Å，Fe-O-Fe角为178.32°。此外，作者通过原位合成实现了将pro-5FU和pro-5EU封装到PHOF-1（E-F@PHOF-1）中。

图2. PHOF-1的晶体结构

图3. HOF-基生物正交催化剂的表征

体外催化性能

Apt@PHOF-1的催化能力源于其铁卟啉（Fe-por）单元，它可在生物硫醇存在下催化芳基叠氮化物还原为相应的胺。简而言之，在GSH将Fe^III还原为活性Fe^II后，叠氮化物底物与Fe-por结合并生成初始叠氮化物-Fe-por配合物，该配合物随后经过N₂的损失生成亚氮-Fe^IV中间体，并在另一个GSH催化下生成氨基产物。

当Apt@PHOF-1在GSH存在下催化时，母体香豆素被释放，荧光恢复。在Apt@PHOF-1和GSH分别存在下，香豆素前体的荧光变化不明显，而Apt@PHOF-1和GSH共存时，样品荧光显著增加，表明GSH在Apt@PHOF-1介导的催化反应中起着至关重要的作用。

图4. Apt@PHOF-1体外催化性能

细胞和动物实验

RAW264.7作为正常细胞，RAW264.7细胞裂解液的GSH浓度比HCT116低十倍以上。共聚焦显微镜结果显示，仅在Apt@PHOF-1和原香豆素处理的HCT116细胞中，由于Apt@PHOF-1在谷胱甘肽的帮助下有效地降解了原香豆素，观察到较强的蓝色荧光，而RAW264.7未见明显荧光。

同时，pro-Rh110活化的共聚焦显微镜和流式细胞术研究结果与香豆素原活化的结论相同。细胞裂解液的LC-MS分析表明，5FU和5EU在HCT116细胞中都被成功激活，而在RAW264.7细胞中几乎没有检测到5FU或5EU，表明该策略进行肿瘤选择性前药激活的可行性。

图5. Apt@PHOF-1在细胞中催化性能

Apt@PHOF-1即使在100 μg ml⁻¹的高浓度下，HCT116和RAW264.7细胞存活率仍保持在90%以上，表明其具有良好的生物相容性。对比5FU，5FU与5EU以1: 1摩尔比混合表现出更强的抑制效果。

5FU的IC₅₀值为47.2 μM，5FU与5EU混合后的IC₅₀变为0.622 μM。根据杀伤曲线，选择10 μM为最佳给药浓度，最终给药剂量为50 μg ml⁻¹。Apt@PHOF-1和Apt@F@PHOF-1对HCT116的增殖抑制率分别为15.69%和60.26%，Apt@E-F@PHOF-1对HCT116的增殖抑制率高达87.27%。

图6. HOF-基生物正交催化剂的细胞杀伤性能

利用cy3吸附的Apt@PHOF-1纳米颗粒处理12 小时的小鼠，其肿瘤荧光比cy3吸附的PHOF-1更强，因为AS1411适配体的修饰。在治疗14天后，注射Apt@E-F@PHOF-1（IV组）的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，而在I组和II组没有观察到明显的抗癌作用，所有小鼠的体重波动都可以忽略不计。Apt@F@PHOF-1（III组）的中等治疗效果可能是由DPD介导的5FU分解代谢引起。

肿瘤组织的H&E染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP Ni-端标记（TUNEL）实验，表明Apt@E-F@PHOF-1可通过增强化疗来促进癌细胞凋亡。

图7. 动物实验

文献信息

Hydrogen-bonded organic framework-based bioorthogonal catalysis prevents drug metabolic inactivation. Nature Catalysis., 2023, DOI: 10.1038/s41929-023-00999-0.

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