哈工程盖世丽/杨飘萍等综述：深入揭示纳米酶的设计策略、催化机制和癌症治疗模式

自2007年发现Fe₃O₄纳米粒子的类酶活性以来，纳米酶以其催化活性高、成本低、反应条件温和、稳定性好及适合大规模生产等优点，成为天然酶最具潜力的替代品。近年来，随着纳米医学和纳米催化的交叉融合，基于纳米酶的治疗策略引起了人们的极大关注，因为酶催化反应可以在肿瘤微环境中触发，达到良好的治疗效果，具有底物特异性和低副作用的优点。本文综述了纳米酶的发现和发展简史，讨论了纳米酶的分类及其催化机理。并重点介绍了密度泛函理论、机器学习、仿生和化学设计等方法对纳米酶活性的预测和理性设计。然后，介绍了纳米酶的协同治疗策略。最后，概述了纳米酶用于肿瘤治疗的当前挑战和未来前景，包括选择性、生物安全性、重复性、稳定性、催化机制、活性预测和评估。

2. 重点介绍了纳米酶的活性预测和理性设计方法，包括密度泛函理论、机器学习、仿生和化学设计。

I 纳米酶的分类和催化机制研究

图1. (a)天然HRP和(b)金属氧化物纳米酶的催化反应路线图；(c,d)类POD纳米酶的催化机制；(e)基于标准氧化还原电位的普鲁士蓝纳米粒子的多重酶活性和催化机制示意图。

OXD通过有效和选择性利用O₂在需氧生物进化中的关键作用而备受关注，O₂是一种容易获得且对环境无害的氧化剂。众所周知，生物圈中大部分O₂消耗是由血红素-铜氧化酶的家族催化的，例如细胞色素c氧化酶。同时，OXD在制药、食品、生物技术等行业X有着广泛的应用。OXD在O₂(电子受体)存在下可以催化底物(电子供体)氧化为相应的氧化产物，同时产生H₂O或H₂O₂。最近，许多无机纳米材料被发现在O₂的帮助下可催化一种或多种底物的氧化，表现出类OXD活性，如铈基氧化物、贵金属(Au、Pt和Pd等)、锰基氧化物、MOFs等。并根据底物被氧化基团对类OXD纳米酶进行了分类，如类多酚氧化酶、类葡萄糖氧化酶(类GOₓ)、类细胞色素C氧化酶、类亚硫酸盐氧化酶等。具有类OXD活性的纳米酶催化底物的氧化过程，并且伴随电子转移催化过程可以通过温度、pH和底物进行调节。他们的反应也遵循Michaelis–Menten动力学。

CAT是人体中最重要的氧化还原酶之一。CAT可以催化H₂O₂分解成H₂O分子和O₂，在催化去除活性氧物种(ROS)、防止细胞膜损伤和抑制肿瘤细胞生长方面起着至关重要的作用。另外，CAT是过氧化物酶的一种标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%，广泛存在于细胞的过氧化物酶体内。但在实际应用中，具有天然酶固有的稳定性差、保存困难等缺点。应运而生的纳米酶也被用来模拟CAT活性。迄今为止，金属、金属氧化物、MOFs、碳基纳米材料、金属硫化物和普鲁士蓝等材料被先后证明具有类CAT酶活性，并在肿瘤治疗、免疫检测等方面被广泛运用。探索内在催化机理对于开发类CAT纳米酶是必要的。基于密度泛函理论(DFT)计算，研究者们开展了一系列理论研究，探索类CAT纳米酶的催化机理。事实证明，不同的类CAT纳米酶具有不同的催化机理。一般来说，H₂O₂有两种类型的化学键，即H−O键和O−O键。根据H₂O₂不同的键断裂方式，可以将类CAT纳米酶的催化机制归纳为异裂反应和均裂反应两类。

SOD是一组金属酶，可催化O₂·⁻歧化为H₂O₂和O₂。天然SOD存在于大多数原核细胞和一些真核细胞中，并且广泛存在于各种细胞器中。根据不同的辅因子，天然SOD酶分为锰SOD(MnSOD)、铁SOD(FeSOD)、铜锌SOD(CuZnSOD)和镍SOD(NiSOD)四种类型。作为对抗ROS介导损伤的第一道防线，SOD有望在氧化应激相关疾病的治疗中发挥重要作用。然而，SOD的临床应用受到其结构不稳定性和高成本的严重限制。到目前为止，已经发现大约100种纳米酶表现出类SOD的活性，其中富勒烯和CeO₂是最广为人知的。

水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，也可以说它们是一类特殊的转移酶，用水作为被转移基团的受体。水解酶可以催化一系列独特化学键的水解。例如，核酸酶可以裂解多核苷酸链的磷酸二酯键，酯酶能将酯水解为酸和醇。水解纳米酶是具有类似水解酶活性的纳米材料，根据水解底物的不同分为核酸酶、酯酶、磷酸酶、蛋白酶等。近年来，已经报道了大量的水解纳米酶，例如胶束，囊泡和纳米颗粒。胶束和囊泡的状态在很大程度上取决于溶剂的性质、溶液的离子强度和添加剂的存在，然而对拓扑结构和催化位点的控制有限。而对于纳米颗粒，拓扑结构和催化位点可以得到很好的控制。

II  纳米酶的活性预测及合理设计

由于纳米材料的成分复杂且催化位点模糊，因此缺乏对颗粒与纳米酶活性之间关系的基本了解。如何有效设计纳米酶是该领域急需解决的关键问题之一。目前，在纳米酶的设计和合成中，通常使用经验和“试错”方法。制备所需特征纳米酶通常需要重复实验，并且成功率极大依赖于研究人员的直觉和经验，且采用“试错”方法制备的类POD纳米酶的活性通常较低，一般比HRP低几个数量级。因此，如何有效设计纳米酶对进一步扩大研究和促进实际应用具有重要意义。目前为止，已经开发了多种有效设计纳米酶的策略，主要包括DFT、机器学习、仿生设计和化学设计。

纳米材料的优异特性丰富了纳米酶活性调控手段，同时伴随着纳米合成技术的发展，实验制备的纳米酶数量不断增加，而如何从如此庞大的材料库里高效获得高性能纳米酶成为一个巨大的挑战。近年来，计算机辅助的高通量筛选成为较为热门及有效的筛选手段，可从大量材料中对其特定性能进行快速评价，从而筛选出所需材料。作为人工智能的一个分支，机器学习旨在开发计算算法，以基于现有数据推断数学模型，这为加速开发所需的纳米颗粒提供了一种有前途的工具。鉴于纳米酶的复杂性和多样性。图2介绍了机器学习预测纳米酶过程示意图。

科研工作者提出了一种计算辅助的类POD纳米酶筛选和设计的通用方法，用于“从头”预测类POD纳米酶的催化活性。该方法主要采用密度泛函方法对类POD纳米酶进行高通量计算。研究者以最早的氧化铁类POD纳米酶为模型，构建了多种具有不同化学组成、晶格缺陷、暴露晶面和化学修饰的纳米氧化铁表面。此外，研究这些表面在模拟类POD催化H₂O₂分子氧化有机底物的分子机理和反应动力学，总结该类催化反应的机制特征。其次，基于化学反应原理进行近似处理和推导，导出预测氧化铁类POD活性的能量描述符、火山型曲线和催化活性窗口。目前，已经对57种金属、单金属氧化物、钙钛矿和碳材料进行了计算验证，证明该模型可适用于其他遵循类似催化机制的类POD纳米酶。证实了高通量计算筛选可实现纳米酶高效设计，加快纳米酶领域的研究，并对实验具有一定的指导意义。

近年来，很多研究尝试将天然酶的核心催化元件通过仿生模拟的手段嫁接至纳米酶的结构中。许多为天然酶提供高催化活性的因素已经被研究者们用来指导纳米酶的结构设计，例如仿生结合位点、组成、配位化学以及缺陷工程，合成了一系列具有高效催化活性的纳米酶。一些仿生手段开发的纳米酶的催化活性接近甚至超过天然酶。目前，通过生物启发策略理性设计高活性纳米酶已成为当前研究的热点。通常，天然酶可以高活性和选择性有效地催化底物的化学反应。天然酶活性中心附近的结合口袋的结构和组成提供了有利的疏水空间微环境，这对于高催化效率尤为重要。特别是，结合口袋中的一些氨基酸位于天然酶的催化活性位点附近，可以通过非共价相互作用帮助富集、组织和激活底物。受这些独特功能的启发，人们设想通过修饰特定的氨基酸和构建有利的空间结构来定制活性位点周围的催化微环境，这可能是构建催化活性更接近天然酶的纳米酶的一种有前途的策略。Fe₃O₄纳米材料已被广泛报道具有类似过氧化物酶的活性，在于表面有大量的三价铁和二价铁，其催化方式类似于HRP活性位点中的血红素基团。催化动力学分析表明，Fe₃O₄对底物的催化效率与HRP相当，但与底物结合的能力远低于HRP。

图2. 机器学习预测纳米酶过程示意图。(a)从收集数据库到网络资源DiZyme开发示意图；(b-e)多种人工神经网络方案示意图；(f)源自920条数据的内部影响因素和外部影响因素分布图；(g)定量模型预测的类POD和类OXD活性的实验验证结果。

III  纳米酶用于体内疗效诊断

图3.  (a)DOx-CACN用于可切换MRI精确监测铁死亡相关协同治疗机制示意图；(b,c) DOx-CACN产生的ROS和释放的DOx量与MRI信号的关系图；(d,e) DOx-CACN的体内荧光和MRI检测结果；(f)可监测¹⁹F/¹H-MRI信号的PFOB@MnOₓ用于诊疗一体化过程示意图；(g)小鼠体内的T¹-MRI和¹⁹F-MRI检测结果；(h) MSPN的NIRF-PA成像功能用于类OXD活性检测过程示意图；(i, j)体内的归一化荧光强度比和PA比。

IV  纳米酶用于多模式抗癌治疗研究

在生物体中，许多生化过程通过一系列酶促反应以级联方式在细胞中同时发生来完成生命活动过程。生物系统中的酶级联反应由于扩散势垒降低、中间体的局部浓度高和传质效率高，可以有效提高酶反应的催化性能。然而，由于天然酶自身固有的缺陷，酶串联反应体系表现出反应条件严格、稳定性差等局限性，阻碍了其在生物医学领域的进一步应用。纳米酶作为酶的替代品，不同的纳米酶具有不同的类酶活性，通过不同方式将多种纳米酶集成到一个平台，构建的级联催化体系，可有效提高催化效率。另外，某些纳米酶本身能够模拟多种不同的酶活性，为构建仿生自级联反应体系提供了新机遇。级联途径通常遵循一种酶的反应产物作为另一种酶的底物的顺序方式。例如，GOₓ或类GOₓ纳米酶可以通过催化肿瘤内葡萄糖产生显著的H₂O₂分子来引发反应，随后的纳米酶参与的催化反应以H₂O₂分子为底物通过类POD活性催化产生·OH，毒性的·OH可用于抗肿瘤治疗或者生物传感。

基于这个背景，近年来越来越多的级联纳米诊疗体系被开发，用以放大肿瘤效果。陈春英等设计了一种酸性肿瘤微环境响应及超声介导的级联纳米催化剂(BTO/MoS₂@CA)(图4a-c)，通过将pH响应性肉桂醛(CA)释放介导的、自供应H₂O₂及正负电荷增强的酶活性整合在一起，表现出卓越的特异性和协同性的肿瘤治疗效果。此外，陈雨等人报道了一种以钙钛矿纳米晶体为基底的超声增强酶动力治疗策略(图4d-f)。考虑到多酶催化反应需要高水平的H₂O₂充当底物，但肿瘤微环境中H₂O₂含量不足以实现理想的治疗效果，引入GOₓ并在级联催化反应过程中充当酶动力学反应的反应物，作为肿瘤特异性H₂O₂生成器。此外，外源性超声可以通过加速中间复合物向Fe(II)的转换速率来促进ROS的产生。通过转录组测序分析、ELISA试剂盒评估和蛋白质印迹分析证明产生的ROS可通过ROS-TXNIP-NLRP3-GSDMD通路诱导焦亡。

图4. (a) BTO/MoS₂@CA的合成及压电催化机理示意图；(b，c)采用流式细胞术和蛋白质印迹法分析BTO/MoS₂@CA浓度对ROS生成量和GPX4表达情况的影响；(d)LFO@GOₓ的合成过程和超声增强的酶催化治疗机理示意图；(e)环形热图；(f)蛋白质-蛋白质相互作用网络图。

V 结论和展望

近年来，纳米酶以其高催化活性、温和的反应条件、良好的稳定性以及纳米材料的物理化学性质引起了研究人员的广泛关注，并用于抗癌治疗策略探索。可以根据实际需求，将纳米酶运输到相应的细胞微环境中，发挥作用。因此，基于肿瘤微环境独特的生理环境和代谢产物，设计具有肿瘤特异性治疗和诊断功能的多功能纳米酶具有广阔的发展前景和应用前景。未来的研究可基于以下几个方面进行。

(1) 纳米酶的催化机理和关键催化位点需要深入分析。目前，对纳米酶的研究大多集中在优化催化活性上，对催化机理的分析较少。此外，除了少数单原子纳米酶外，很少有报道揭示纳米酶的催化位点的关键结构信息。

(2) 需要对DFT和机械学习开展进一步的研究，以预测和评估纳米酶的活性。尽管使用了理论计算等方法预测纳米酶的催化路径，但很少有研究能够结合实验验证来解释纳米酶的催化机制和构效关系。

(3) 纳米酶通常具有多种酶活性，而不同酶活性之间的关系、相互影响、增强或抑制方法以及原因需要解决。如何提高纳米酶催化特定底物或一类类似物的选择性？该研究对只需要单一酶活性的应用领域具有重要意义。

(4) 对于癌症的诊断和治疗，揭示肿瘤微环境与纳米酶的催化效率和选择性之间的关系是非常重要的。此外，需要揭示纳米酶在生物环境中的活性和选择性调节方式，因为大多数纳米酶的活性在生物环境中被抑制。目前，内在的结构工程(如掺杂和缺陷工程)和外部触发因素(如温度、超声、光和小分子)已被用于生物环境中纳米酶的活性调节。然而，深入细致的调控策略仍需深入探索。

(5) 纳米酶的生物安全性需要进一步探索。一方面，与其他纳米材料类似，纳米酶的毒理学研究，包括长期细胞毒性、给药、代谢、排泄、生物分布、药代动力学、大型动物的药效学和体内实验等仍未得到证实。另一方面，对于催化治疗效果，纳米酶的靶向性、选择性、特异性、体内活性和定位仍不清楚。体内微环境复杂，因此纳米酶在体内的催化路径往往是不可控的。同时，潜在的体内生物催化反应和生物界面的机制也很难预测，所有这些都将成为影响生物安全的因素。因此，需要对纳米酶的体内稳定性、药代动力学(如摄取、分布和代谢)、治疗效果的持续时间和毒性(如溶血和凝血分析)进行系统的研究和分析。

(6)纳米酶的协同治疗策略已被广泛报道，而不同治疗模式之间的相互影响、促进和协同机制需要利用新技术和手段进行深入验证。

(7) 纳米酶催化活性的重复性和稳定性有待研究。多数报道集中在新纳米酶的发现上，而很少有关于稳定性等的验证研究。这些问题的解决有望加速纳米酶的工业应用。

(8) 阐明治疗分子机制的多种组学分析方法需要深入探索。应致力于在不同分子水平上进行多组学分析，如基因组、转录组、蛋白质组、表观基因组、代谢组和微生物组，以获得相关的组学数据，更深入地了解治疗过程中各种分子之间的调节和因果关系。