颜宁院士，2024年最新PNAS！

研究背景

随着对生物膜电生理学的深入研究，科学家对电压门控钠（Nav）通道的结构和功能关系产生了广泛的兴趣。Nav通道在调节神经元和肌肉细胞的膜兴奋性中起着关键作用，对于产生和传导行动电位至关重要。Nav通道的结构和功能异常与多种疾病，如癫痫、心律失常和疼痛障碍等病理状态密切相关。因此，对Nav通道的深入理解不仅对于基础科学研究，也对于疾病治疗和药物开发具有重要意义。然而，Nav通道的结构和功能之间的关系以及与不同功能状态相关的构象仍然不清楚。尤其是在Nav通道的电机械耦合过程中，即在膜电位变化导致通道构象转变的机制中存在很多未知之处。此外，尽管已经报道了几种Nav通道的结构，但多数情况下这些结构代表了一种失活状态，缺乏不同功能状态下的结构信息。

为了解决这些问题，清华大学/深圳医学科学院颜宁团队在PNAS在线发表“Dissection of the structure–function relationship of Nav channels”的研究成果，她们采用了多种策略，其中包括通过引入点突变来改变Nav通道的结构，以及引入状态依赖性的毒素或药物来调控Nav通道的功能。通过这些方法，研究人员试图获取Nav通道在不同功能状态下的结构信息，以更全面地理解Nav通道的结构与功能关系。本研究旨在深入探究人类Nav1.7通道的结构与功能之间的关系。通过系统地引入突变并解析这些突变体的结构，研究人员试图揭示不同构象与Nav通道功能状态之间的联系，特别是在通道的激活和失活过程中。通过这些结构分析，研究人员解决了Nav通道在不同功能状态下的结构特征，并提供了对Nav通道电机械耦合过程的新见解。

图文导读

为了揭示Nav1.7通道的结构与功能关系，研究者进行了合理设计的突变体研究。在该研究中，通过将人类Nav1.7通道的九个突变位点替换为NavPaS的相应残基，生成了Nav1.7-M9突变体，该突变体具有更紧密的孔道结构和完全关闭的门。通过与WT和M11结构的比较，研究者发现Nav1.7-M9的整体构象介于WT和M11之间，其PD与M11相似，而VSDI和VSDII与WT相似。这表明Nav1.7-M9突变体的结构介于激活态和静息态之间，具有重要的结构和功能特征。此外，通过HOLE计算发现，Nav1.7-M9的孔道收缩点半径与M11几乎相同，比WT窄约1.5 Å。这一发现与先前的分析结果一致，即在窗口中引入较大的疏水残基会增加开放孔道的能量壁垒（见图1）。

图1. 我们对Nav1.7变异体的理性设计概述

为了研究Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之间的结构差异，研究者在图2A中发现尽管M9和WT之间的VSDs在整体上相似，但VSDI和VSDII存在轻微的构象偏离。具体而言，M9中的VSDI呈现向上的构象，而VSDII完全向上。在图2B中，研究者观察到PD之间的结构偏差。在M9中，S6II和S6IV段经历了从α到π的转变，导致了S4-5II、S6II和S6III的协同运动，以及S4-5I与相邻的S4-5II和S5II之间的协调运动。这些发现表明，尽管M9和WT之间的VSDs保持了相似性，但其PD之间存在显著的构象变化。这些结构差异的发现为我们深入理解Nav1.7通道的结构与功能关系提供了重要线索，有助于揭示其电机械耦合的分子机制。

图2. Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之间的结构差异

研究者为了进一步探究Nav1.7通道的结构与功能之间的关系，进行了对Nav1.7-M9和Nav1.7-WT的结构比较与突变分析。图3分为三个部分（A、B、C），展示了对Nav1.7通道突变体的生物物理特性和结构构象的详细研究。在图3A中，研究者首先进行了对PD突变的合理性分析，发现Nav1.7中的九个突变足以将PD锁定在紧密的构象中。进一步的突变分析表明，PD上半部分的突变并没有改变主链的位置，而下半部分的突变导致了明显的结构变化，这对理解PD构象的微小差异提供了关键信息。在图3B中，研究者展示了额外Nav1.7突变体的电生理特性。他们观察到单点突变L866F或G1454C导致激活电压依赖性曲线右移，而T870M导致左移。当将L866F和G1454C组合在一起时，激活曲线进一步右移。这些结果揭示了突变对Nav1.7通道电生理特性的影响，为进一步理解Nav通道的功能提供了重要线索。在图3C中，研究者展示了Nav1.7-M2和Nav1.7-M4的结构分析结果。通过电子显微镜分析，他们发现这两个突变体的结构几乎与WT相同，尽管含有额外的突变。这表明，尽管VSD突变可能引起结构变化，但它们不会改变PD的构象，这对于理解Nav通道的整体结构具有重要意义。

图3. 两个Nav1.7变体的构象与WT相同

研究者通过图4展示了Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的结构异质性增加情况。在图4A中，研究者通过比较不同构象下的粒子选择百分位，发现M9和M11相比M2和M4具有更高的结构异质性。这表明在缺乏任何膜电位的条件下，这两种突变体具有更大的结构灵活性。进一步观察3D电镜地图，研究者发现突变数目的增加与S6片段的α → π转变（或者说PD的收紧）相关联（图4B）。在WT中，S6II和S6IV仅由α螺旋转组成。而在M9和M11中，这两者都在中间螺旋转进行了α → π转变。而对于M2和M4，尽管我们将S6IV建模为α螺旋转，但局部密度的模糊性表明存在另一种构象，与存在门控调节剂毒素Huwentoxin IV（HWTX-IV）或Protoxin II时Nav1.7的3D重建中看到的情况类似。这些结果表明，突变体的结构异质性与PD的收紧以及S6段的α → π转变密切相关（见图4）。

图4. Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的构象异质性增加

研究者在图5中展示了Nav通道的PD的结构-功能关系。图5A展示了PD的三种解析状态：放松、中间和紧密。放松的PD具有四个窗孔和类固醇样分子穿透的特征，而紧密的PD则具有封闭的细胞内门和缩小的或封闭的窗孔。图5B展示了非导电PD可能对应的多种构象，其中M9和M11显示了紧密PD，而WT则显示了放松的PD。通过比较Nav1.7-M9、M11、WT和HS-π的PD孔径，揭示了PD的多种构象。图5C预测了未来可能被结构解析的Nav变异体的电生理特性。具有右移的激活曲线和进一步右移的静态失活曲线的变体可能代表静息态构象。这些发现对于理解Nav通道的结构和功能之间的关系以及揭示静息态构象的建模具有重要意义。

图5. Nav通道PD的结构-功能关系

结论与展望

本文揭示了电压门控离子通道（VGICs）结构与功能之间的关系，特别是钠离子通道（Nav）的结构动态性如何影响其生理活性。通过系统的结构分析和电生理实验，研究人员发现不同Nav通道变体在结构上的微小差异会导致电生理特性的显著变化，这对于理解离子通道的活动机制至关重要。

此外，研究者们提出了一种通过结构解析Nav通道不同状态的方法，进一步揭示了Nav通道的工作周期，特别是其静息状态的结构特征。这些发现不仅为了解生物膜电位调控和神经传导提供了重要线索，还为设计更精确的离子通道药物靶点提供了理论基础。因此，本研究为进一步探索离子通道的结构与功能之间的关系以及神经元兴奋性调控的分子机制提供了重要的科学启示。

原文详情：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2322899121

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