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研究背景

生物分子凝聚物 (biomolecular condensate) 是具有诸多生物功能的无膜细胞器，如细胞器形成、信号传导、基因转录和蛋白翻译。这些结构被定义为“生物分子凝聚体”，它们的形成受到体内组织、器官和生理环境的影响。然而，相分离失调时会导致病理性凝聚物的形成，从而会导致肿瘤疾病和神经性等疾病。

虽然已经确认了许多蛋白质具有相分离的能力并且能够形成生物分子凝聚物，但在内源水平上，对于哪些蛋白质可以在生理条件下发生相分离，以及它们在这一过程中与何种伙伴相互作用仍然存在许多问题。

因此，科学家们迫切需要一种高通量的蛋白质组学方法，以识别在某些生理事件中发生相分离或分配到凝聚物中的内源性蛋白质。然而，由于这些结构在内源水平上具有小而动态的结构以及复杂的成分，因此分离未知的生理液态/固态凝聚物并以蛋白质组学的方式表征凝聚物蛋白仍然是一项挑战。

成果简介

为了解决这一问题，华中科技大学生命学院刘笔锋和李一伟教授等合作者联合提出了一种新策略，旨在通过将蛋白质在细胞中排序为不同的寡聚态来识别生物分子凝聚物并筛选其候选相分离蛋白质。通过使用渗透压压缩轻微调节细胞内蛋白质浓度和分子拥挤度，研究人员成功发现了1518个内源表达水平的凝聚物蛋白质，其中包括538个尚未被报道的凝聚物蛋白质。

该方法有利于快速扩展内源性生物分子凝聚物的数据集，并能筛选出特异性响应的候选相分离蛋白质。这项研究成果在线发表在Nature Chemistry杂志上，题为“High-throughput and proteome-wide discovery of endogenous biomolecular condensates”，引起了广泛关注！

图文导读

为了高通量识别生物分子凝聚物，研究者在图1a中首先使用了蔗糖密度梯度超速离心的方法，将细胞裂解液中的蛋白质按照其密度分离出来，随后利用定量质谱技术对不同密度梯度分数中的蛋白质进行了检测和识别。研究者通过这一步骤识别出了具有不同的寡聚蛋白质，作为生物分子凝聚物的成分，以及候选的相分离蛋白质。在图1b中，研究者采用了渗透压压缩的方法来动态扰动相分离蛋白质的程度。通过使用高渗介质（含有5%聚乙二醇（PEG）300）来减小细胞的体积，研究者实现了细胞浓度的增加和分子拥挤度的提高。这种操作使得相分离蛋白质的聚态发生改变，进一步帮助识别生物分子凝聚物的组分。

图1. 生物分子凝聚物高通量识别的示意图。

在图2中，研究者进行了高通量鉴定相分离蛋白质的实验。图中分为多个部分，其中a部分展示了实验的可重复性，通过皮尔逊相关系数显示了实验数据之间的良好相关性。b部分显示，在8,425种检测到的蛋白质中，有1,050种被确定为生物分子凝聚物（BMCs）中的蛋白质。其中625种已经在PhaSepDB数据库中报道为相分离蛋白质，而剩余的425种被确定为尚未报道的相分离候选蛋白质。c部分展示了在每个分数中检测到的新蛋白质和新发现的候选蛋白质的数量。d部分显示了11种已知无膜细胞器中各个分数中检测到的蛋白质数量，提示了蛋白质的寡聚态分布。e部分表明，来自不同寡聚态的内源相分离蛋白质包含不同的结构域和属于不同的家族。总之，这些结果显示，使用这种高通量方法可以有效地识别和鉴定生物分子凝聚物和相分离蛋白质。

图2. 相分离蛋白高通量识别。

图3的实验旨在验证候选凝聚物蛋白的相分离行为。其中，在a部分作者通过体积压缩验证了内源性表达的凝聚物蛋白。b部分显示了在体积压缩下蛋白质的寡聚态分布发生了转移，其中第六个分数的蛋白质寡聚态发生了显著变化。c部分显示，在第六个分数中总共确定了141种蛋白质为内源性凝聚物蛋白，其中112种已被报道，而29种是新发现的。为了验证报道的112种蛋白质，作者选择了两种蛋白质进行验证，PRDX1和YBX1，结果显示它们在体积压缩下形成的凝聚物结构更大。同时，荧光免疫染色结果进一步确认了它们的凝聚状态。

此外，对四种新发现的凝聚物蛋白质（MTDH、ZNF431、MRPL23和TOE1）进行了进一步研究，结果显示它们在细胞内形成了类似斑点的结构，并且在活细胞成像中观察到了这些结构的融合和分裂。FRAP实验进一步验证了这些蛋白在结构内的动态交换。这些发现为作者理解细胞内凝聚物蛋白的相分离行为提供了重要证据，同时也为凝聚物的功能和机制研究提供了新的视角。

图3. 通过体积压缩识别的凝聚物蛋白的验证。

图4是验证其技术能否鉴定与转化生长因子β（TGF-β）信号通路相关的生物分子凝聚物。为此，他们对H1975细胞进行了短期（40分钟）或长期（两天）的TGF-β处理，并进行了进一步的分析。

图4a中展示了研究者识别内源性凝聚物蛋白的方法示意图。b部分展示了在短期TGF-β处理下蛋白寡聚态分布的变化变化情况。c部分展示了在短期TGF-β处理下鉴定的50种凝聚物蛋白。这些蛋白中，92%（46/50）与TGF-β信号通路相关，包括在TGF-β诱导的无膜细胞器中发现的蛋白、调节TGF-β受体/共受体的蛋白、TGF-β下游调控蛋白和调节TGF-β信号通路上游的蛋白等。

此外，研究者还验证了一些已知蛋白（如EMD和PCNA）以及一些新发现的蛋白（如NCEH1、NAMPT、ASNS和LTA4H）在TGF-β处理后的凝聚物形成行为。通过这些实验结果，研究者成功地鉴定了TGF-β信号通路中参与的凝聚物蛋白，并且提供了更多有关这些蛋白在细胞内作用机制的信息。

图4. 对TGF-β短期处理的凝聚物蛋白的识别。

在图5中他们观察到不同干扰条件下识别的蛋白质模式有所不同。通过对蛋白质的功能进行分类，研究人员发现，这些蛋白质涉及不同的生物过程。在压缩条件下识别的凝聚物蛋白主要与翻译和转录相关（见图5b），而在短期TGF-β刺激条件下观察到的蛋白则与Wnt平面细胞极性（PCP）信号和经典信号的负调节有关（见图5c）。

另一方面，长期TGF-β刺激引发的上皮-间质转化（EMT）导致凝聚物蛋白模式的扩展和变化，涉及到更多的生物过程，如点粘附、RNA结合、紧密连接和Hippo信号传导（见图5d）。通过富集分析，他们发现这些凝聚物蛋白可能参与调节其他重要的生物过程，如成骨细胞分化、肿瘤坏死因子信号、白细胞介素17信号、肥厚型心肌病和心肌收缩。这些发现为作者提供了深入了解相分离蛋白在细胞内生物学过程中的作用的见解，并为进一步研究这些蛋白的功能和调节提供了重要线索。

图5. 内源表达相分离蛋白的蛋白组学分析。

总结展望

本文展示了一种创新的高通量策略，可用于在蛋白质组水平上识别内源性生物分子凝聚物，并筛选参与相分离的蛋白质。通过结合体积压缩和TGF-β信号转导等生物学过程，研究人员揭示了大量内源性蛋白质对相分离的响应，并发现了一系列之前从未报道过的潜在凝聚物形成蛋白质。

此外，研究人员的方法还揭示了细胞体积变化对蛋白质相分离状态的影响，进一步证明了分子拥挤在细胞内物理/机械调控中的重要性。最重要的是，该研究为量化和内源性蛋白质组学提供了一种全新的方法，这将极大地促进对生物分子凝聚物和相分离的深入理解，从而推动基础生物学和转化医学领域的进展。

文献信息

Li, P., Chen, P., Qi, F. et al. High-throughput and proteome-wide discovery of endogenous biomolecular condensates. Nat. Chem. (2024).

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