天然酶在辐射作用下失活，这对其在放射治疗中的应用构成了巨大挑战。在这种极端条件下，具有高结构稳定性的单原子纳米酶（SAzymes）成为替代天然酶缩小肿瘤的有希望的候选物质。
在此，清华大学李亚栋院士，中国科学院高能物理研究所晏亮副研究员和中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心付强特任研究员等人报道了一种以CuN3为中心的SAzyme（CuN3-SAzyme），其通过局部调节单个铜位点的配位环境，比以CuN4为中心的SAzyme表现出更高的过氧化物酶样催化活性。
密度泛函理论计算显示，CuN3活性分子具有最佳的H2O2吸附和解离特性，有助于提高 CuN3-SAzyme的酶活性。同时，X射线的引入可改善CuN3-SAzyme分解H2O2的动力学，且CuN3-SAzyme在接受500 Gy总辐射剂量后非常稳定，其几何结构和配位环境没有发生显著变化，同时仍保持着与天然酶相当的过氧化物酶样活性。
此外，这种开发出来的CuN3-SA 酶具有显著的抗辐射性，可用作外场改进治疗剂，用于增强体外和体内的放射酶疗法。总之，这项研究为开发通过局部配位操作提高酶活性并比天然酶具有更高抗放射性的SAzymes提供了一个范例，进一步可用作癌症治疗的增敏剂。
相关文章以“Enhancing radiation-resistance and peroxidase-like activity of single-atom copper nanozyme via local coordination manipulation”为题发表在Nature Communications上。这也是李亚栋院士三天内刊发的第二篇顶刊！（）
一般来说，天然酶暴露在X射线和γ射线等辐射下，其结构会发生永久性改变，通过直接和间接作用在一定程度上导致失活。由于水占大多数生物组织成分的近80%，X射线可电离水分子，使氢氧键断裂，产生一系列化学反应物种。这些物质会依次向天然酶的表面扩散，通过化学反应破坏酶的生化结构。同时，X射线还能与天然酶的原子相互作用，导致一连串的物理和化学事件，最终引起酶的结构变化甚至化学修饰。因此，X射线和γ射线对天然酶的灭活作用极大地阻碍了它们的各种应用。因此，当前研究的一个主要核心问题是开发具有优异抗辐射能力和酶活性的人工酶，以解决天然酶的局限性，实现其在放疗中的实际应用。
纳米酶表现出内在的仿酶活性，结合了生物催化剂和纳米材料的优势，具有超越天然酶的独特能力，包括低成本、高稳定性和易储存。由于人工酶工程能够在原子和分子水平上调控生物催化活性位点，人们从天然酶的结构中获得灵感，不断设计出具有过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等酶活性的纳米酶。迄今为止，从体外到体内，人们一直致力于了解这些用于肿瘤诊断和治疗的纳米酶。特别是，与氧化铜（CuOx）纳米颗粒相比，具有密集隔离的CuN4位点的铜SAzymes（CuN4-SAzyme）已被证明具有更高的过氧化物酶样活性，但这种Cu-N4配位结构对H2O2的吸附力仍然较弱，导致中间产物直接脱离。
图1a是CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme的合成示意图。以CuN3-SAzyme为例，KCl晶体为模板，与含有Cu(NO3)2和2-甲基咪唑的甲醇溶液混合形成Cu-MOFs层，将得到的前驱体在850℃煅烧2小时。TEM图像显示，CuN3-SAzyme具有典型的二维特征，表面原子般光滑（图 1b），这与拉曼分析结果一致，而CuN4-SAzyme则具有多孔结构的多面体形貌。同时，EDS图谱分析表明，在CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme的整个结构中，C、N和Cu元素的分布均匀一致。此外，还采用电感耦合等离子体光发射光谱（ICP-OES）对铜含量进行了定量分析，CuN3-SAzyme的铜含量为2.98 wt%，CuN4-SAzyme的铜含量为1.21 wt%。
CuN3-SAzyme与CuN4-SAzyme的原子结构比较
本文利用Cu K边X射线吸收精细结构（XAFS）光谱分析了CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme的化学状态和配位环境。X射线吸收近边结构（XANES）光谱对中心金属周围的三维原子排列非常敏感，是识别原子构型的有力工具。图2a显示了CuNx-SAzyme、CuOx纳米酶和Cu K-edge XANES光谱。值得注意的是，CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme 的吸收边位于 CuOx 纳米酶的吸收边之间。对于CuN3-SAzyme而言，吸收边缘更接近于Cu2O纳米酶的吸收边缘，这表明原子分散的铜物种带有正电荷，化合价接近+1。这一发现与CuN3-SAzyme 的Cu2p XPS光谱一致（图2b）。
同时，图2c显示了CuNx-SAzymes的傅立叶变换扩展Cu K-edge X 射线吸收精细结构（FT-EXAFS）光谱，CuN3-SAzyme和CuN4-SAzyme都在1.5 Å附近出现一个主峰，相当于 Cu-N峰，在~2.3 Å处没有明显的峰，表明没有Cu-Cu配位，这证实了没有形成金属结晶铜，只存在孤立的单个铜原子。进一步采用EXAFS小波变换（WT）分析来区分反向散射原子，即使在R空间存在明显重叠的情况下也是如此。如图2g所示，CuN3-SAzyme的WT等值线图在5 Å-1附近显示出一个强度峰，表明铜原子和轻原子之间存在配位。
图2：基于XAFS对CuN3-SAzyme的原子结构进行分析。
受能够改变SAzymes活性的化学微环境的启发，作者接下来对CuNx-SAzymes的过氧化物酶样活性进行了评估和比较。计算得出的CuN3-SAzyme在pH值为3.54时的表观比活度（11.33 U mg-1）比CuN4-SAzyme的表观比活度（0.16 U mg-1）高出约71倍，比CuO纳米酶的表观比活度（0.91 U mg-1）高出12倍多，比Cu2O纳米酶的表观比活度（2.08 U mg-1）高出近5倍（图3b）。相反，在相同条件下，不含铜的掺杂N的碳没有显示出明显的催化性能。这些结果表明，调节Cu位点的配位结构，特别是配位数，可以在数量级上提高过氧化物酶样活性。进一步研究发现，这些纳米酶遵循Michaelis-Menten动力学，并确定了稳态动力学参数，以定量比较了它们的催化特性。
为了研究CuN3-SAzyme的酶活性，作者进行了DFT计算。研究发现，CuN3-SAzyme上的Cu单原子与H2O2分子之间存在很强的相互作用，使得H2O2的解离是一个无障碍过程，而CuN4-SAzyme的这种相互作用很弱，因此H2O2不能吸附在其上。同时，CuN3-SAzyme中的大部分Cu d态位于费米级以下2 eV的能量范围内，并且d态在费米级附近的单个Cu原子上有显著分布。然而，对于CuN4-SAzyme上的单个Cu原子，其绝大多数d态位于费米水平以下2 eV以外，费米水平附近的Cu d态分布也较小。
此外，CuN3-SAzyme上的单个Cu原子突出于石墨烯平面2 Å以上，比CuN4-SAzyme上的面内Cu原子更容易与H2O2结合。此外，图4b显示了在两个实验pH值（3.54和6.49）下H2O2分子在CuN3-SAzyme上解离的计算能量曲线。H2O2中O-O键的裂解和随后H2O分子的形成对CuN3-SAzyme来说都是很容易发生的过程，这进一步证明了其出色的酶活性。
图4：CuN3-SAzyme过氧化物酶样活性的DFT计算。
由于CuN3-SAzyme具有放射增强过氧化物酶样活性和显著的光热性能，作者将CuN3-SAzyme作为一种有效的治疗药物用于增强放射酶疗法。在生物医学应用中，首先通过超声波将CuN3-SAzyme切割并还原成微小的薄片，其平均流体力学直径约为280 nm，Zeta 电位为-9.70 mV。CuN3-SAzyme可通过凝集素介导的内吞作用内化到细胞中，并引发浓度依赖性死亡，对4T1细胞的半最大抑制浓度（IC50）为13.12 μg mL-1，对K7M2细胞的最大抑制浓度（IC50）为18.50 μg mL-1（图5a）。相比之下，由于过氧化物酶样活性较低，CuOx 纳米酶和CuN4-SAzyme在相同的培养浓度下表现出较低的毒性。此外，CuN3-SAzyme对作为正常模型的细胞具有较高的IC50值（23.18 μg mL-1）。由此推断，CuN3-SAzyme对肿瘤细胞具有高效的选择性抑制能力。
图5：CuN3-SAzyme的体内外增强放射酶治疗。
综上所述，作者通过调节局部配位数，制备了一种具有Cu-N3配位的单原子铜酶（CuN3-SAzyme）。与CuN4-SAzyme和CuOx纳米酶相比，这种CuN3-SAzyme的酶活性和动力学性能都要高得多。密度泛函理论（DFT）计算表明，设计的CuN3活性分子赋予 CuN3-SAzyme显著的过氧化物酶活性。此外，当暴露于辐射剂量高达500 Gy的X射线时，CuN3-SAzyme比天然过氧化物酶更稳定。有趣的是，X射线的引入能增强CuN3-SA酶的过氧化物酶样活性和动力学特性。CuN3-SAzyme兼具卓越的抗辐射性和酶活性，可用于增强放射酶疗法，解决天然酶应用所面临的关键问题。
Jiabin Wu, Xianyu Zhu, Qun Li, Qiang Fu, Bingxue Wang, Beibei Li, Shanshan Wang, Qingchao Chang, Huandong Xiang, Chengliang Ye, Qiqiang Li, Liang Huang, Yan Liang, Dingsheng Wang, Yuliang Zhao, Yadong Li, Enhancing radiation-resistance and peroxidase-like activity of single-atom copper nanozyme via local coordination manipulation, Nature Communications, https://doi.org/10.1038/s41467-024-50416-8
Science系列、JACS、Angew、PNAS、AM等世界顶级科学期刊上大放异彩。
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